Microscopio a matrice di riflessione

Microscopio ottico in grado di fotografare immagini attraverso un cranio intatto e acquisire una mappa microscopica delle reti neurali nei tessuti cerebrali senza perdere la risoluzione spaziale.

Le tecniche microscopiche non invasive come la microscopia a coerenza ottica e la microscopia a due fotoni sono comunemente utilizzate per l'imaging in vivo dei tessuti viventi.

Quando la luce passa attraverso materiali torbidi come i tessuti biologici, vengono generati due tipi di luce: fotoni balistici e fotoni diffusi moltiplicati. I fotoni balistici viaggiano direttamente attraverso l'oggetto senza subire alcuna deviazione e quindi vengono utilizzati per ricostruire l'immagine dell'oggetto. D'altra parte, i fotoni diffusi in modo multiplo vengono generati tramite deflessioni casuali mentre la luce passa attraverso il materiale e si presenta come rumore maculato nell'immagine ricostruita. Man mano che la luce si propaga attraverso distanze crescenti, il rapporto tra fotoni diffusi e balistici aumenta drasticamente, oscurando così le informazioni dell'immagine. Oltre al rumore generato dalla luce diffusa moltiplicata, l'aberrazione ottica della luce balistica causa anche la riduzione del contrasto e la sfocatura dell'immagine durante il processo di ricostruzione della stessa.

I tessuti ossei in particolare hanno numerose strutture interne complesse, che causano una grave dispersione multipla della luce e una complessa aberrazione ottica. Quando si tratta di imaging ottico del cervello di topo attraverso un cranio intatto, le strutture sottili del sistema nervoso sono difficili da visualizzare a causa del forte rumore maculato e della distorsione dell'immagine. Questo è problematico nella ricerca neuroscientifica, dove il topo è ampiamente utilizzato come organismo modello. A causa della limitazione delle tecniche di imaging attualmente utilizzate, il cranio deve essere rimosso o assottigliato per investigare microscopicamente le reti neurali dei tessuti cerebrali sottostanti.

Quindi sono state suggerite altre soluzioni per ottenere immagini più profonde dei tessuti viventi. Ad esempio, negli ultimi anni la microscopia a tre fotoni è stata utilizzata con successo per visualizzare i neuroni sotto il cranio del topo. Tuttavia, la microscopia a tre fotoni è limitata da una bassa frequenza di ripetizione del laser poiché utilizza una finestra di eccitazione nella gamma dell'infrarosso, che può danneggiare il tessuto vivente durante l'imaging in vivo. Ha anche un potere di eccitazione eccessivo, il che significa che il photobleaching, o bleaching, (la diminuzione della fluorescenza di un campione dovuta alla degradazione fotochimica del fluoroforo) è più esteso rispetto all'approccio a due fotoni.

Recentemente, un team di ricerca guidato dal Professor Wonshik Choi (1) presso il Center for Molecular Spectroscopy and Dynamics presso l'Institute of Basic Science (IBS) di Seoul, Corea del Sud, ha compiuto un importante passo avanti nell'imaging ottico dei tessuti profondi. Un articolo pubblicato su Nature Communications (2) divulga lo sviluppo di un nuovo microscopio ottico in grado di acquisire immagini attraverso un cranio di topo intatto e acquisire una mappa microscopica delle reti neurali nei tessuti cerebrali senza perdere la risoluzione spaziale.

Questo nuovo microscopio è definito come un microscopio a matrice di riflessione e combina le potenze dell'hardware e dell'ottica adattiva computazionale (AO), una tecnologia originariamente sviluppata per l'astronomia terrestre per correggere le aberrazioni ottiche. Mentre il microscopio confocale convenzionale misura il segnale di riflessione solo nel punto focale di illuminazione ed elimina tutta la luce fuori fuoco, il microscopio a matrice di riflessione registra tutti i fotoni dispersi in posizioni diverse dal punto focale. I fotoni dispersi vengono quindi corretti dal punto di vista computazionale utilizzando un nuovo algoritmo AO chiamato accumulo a ciclo chiuso di dispersione singola (CLASS), sviluppato dal team nel 2017. L'algoritmo sfrutta tutta la luce diffusa per estrarre selettivamente la luce balistica e correggere l'aberrazione ottica grave. Rispetto ai sistemi di microscopia AO più convenzionali, che richiedono riflettori puntiformi luminosi o oggetti fluorescenti come stelle guida in modo simile all'uso di AO in astronomia, il microscopio a matrice di riflessione funziona senza alcuna etichettatura fluorescente e senza dipendere dalle strutture del bersaglio. Inoltre, il numero di modalità di aberrazione che possono essere corrette è più di 10 volte maggiore di quello dei sistemi AO convenzionali.

Il microscopio a matrice di riflessione ha un grande vantaggio in quanto può essere combinato direttamente con un microscopio convenzionale a due fotoni che è già ampiamente utilizzato nel campo delle scienze della vita. Per rimuovere l'aberrazione sperimentata dal fascio di eccitazione del microscopio a due fotoni, il team ha implementato un'ottica adattiva basata su hardware all'interno del microscopio a matrice di riflessione per contrastare l'aberrazione del cranio del topo. Hanno mostrato le capacità del nuovo microscopio acquisendo immagini in fluorescenza a due fotoni di una colonna vertebrale dendritica di un neurone dietro il cranio del topo, con una risoluzione spaziale vicina al limite di diffrazione. Normalmente un microscopio convenzionale a due fotoni non può risolvere la delicata struttura della colonna vertebrale dendritica senza rimuovere completamente il tessuto cerebrale dal cranio. Questo è un risultato molto significativo, poiché il gruppo sudcoreano ha dimostrato la prima immagine ad alta risoluzione di reti neurali attraverso un cranio di topo intatto. Ciò significa che ora è possibile indagare sul cervello del topo nei suoi stati più nativi.

Il professore di ricerca YOON Seokchan e lo studente laureato LEE Hojun, che ha condotto lo studio, hanno dichiarato: «Correggendo la distorsione del fronte d'onda, possiamo concentrare l'energia luminosa nella posizione desiderata all'interno del tessuto vivente. Il nostro microscopio ci consente di indagare su strutture interne sottili in profondità nei tessuti viventi che non possono essere risolte con nessun altro mezzo. Questo ci aiuterà enormemente nella diagnosi precoce delle malattie e accelererà la ricerca neuroscientifica».

I ricercatori hanno impostato la loro prossima direzione di ricerca per ridurre al minimo il fattore di forma del microscopio e aumentare la sua velocità di imaging. L'obiettivo è lo sviluppo di un microscopio a matrice riflettente senza etichetta con un'elevata profondità di imaging da utilizzare nelle cliniche.

Il vicedirettore Wonshik Choi ha dichiarato: «Il microscopio a matrice di riflessione è la tecnologia di nuova generazione che va oltre i limiti dei microscopi ottici convenzionali. Questo ci consentirà di ampliare la nostra comprensione della propagazione della luce attraverso mezzi di diffusione ed espandere la portata delle applicazioni che un ottico il microscopio può esplorare».

Riferimenti:

(1) Wonshik Choi

(2) Laser scanning reflection-matrix microscopy for aberration-free imaging through intact mouse skull

Descrizione foto: Lo schema del microscopio a matrice di riflessione che è stato sviluppato dai ricercatori dell'IBS Molecular Spectroscopy and Dynamics Research Center. Il sistema utilizza la scansione confocale e un interferometro Mach-Zehnder, simile alla microscopia a coerenza ottica. Tuttavia, invece del rilevamento confocale, le immagini interferometriche delle onde riflesse dal campione vengono misurate utilizzando una telecamera. Inoltre, viene introdotto un modulatore di luce spaziale (SLM) per correggere fisicamente la distorsione del fronte d'onda indotta dal campione. (BS: Divisore del fascio, GMx / y: specchio Galvo, DG: reticolo di diffrazione, sDM: specchio dicroico spettrale, OL: lente obiettiva). - Credit: IBS.

Autore traduzione riassuntiva e adattamento linguistico: Edoardo Capuano / Articolo originale: Scientists invent a new type of microscope that can see through an intact skull